Tuyến đường sắt này đi qua địa bàn 5 tỉnh, thành được bắt đầu từ ga Tân Kiên (TP. Hồ Chí Minh) rồi đi song song với vành đai 2. Đến nút giao Chợ Đệm, cặp theo đường cao tốc TP. Hồ Chí Minh - Trung Lương về Bến Lức (Long An), Trung Lương, Cai Lậy, Mỹ Thuận (Tiền Giang) rồi vượt sông Tiền ở hạ lưu cầu Mỹ Thuận, qua ngoại vi TP. Vĩnh Long. Tiếp tục cặp theo đường cao tốc đến phà Cần Thơ, tuyến đường sắt vượt sông Hậu ở hạ lưu cầu Cần Thơ để nối vào TP. Cần Thơ tại khu vực cảng Cái Răng.

Toàn tuyến có tổng chiều dài 134 km với 10 ga, khổ đường 1.435 mm, tốc độ dưới 200 km/h cho tàu hàng và trên 200 km/h cho tàu khách. Dự án có tổng số vốn đầu tư lên đến 3,6 tỷ USD và sẽ được xây dựng theo hình thức BOT (xây dựng - kinh doanh - chuyển giao).

Sơ đồ lộ trình tuyến đường sắt TP. Hồ Chí Minh - Cần Thơ.

Sau khi tiến hành ký bản hợp tác ghi nhớ, Viện Khoa học & Công nghệ Phương Nam và Tập đoàn EDES Hoa Kỳ sẽ thành lập công ty liên doanh, tiến hành lập dự án khả thi trình Bộ GTVT và Chính phủ phê duyệt. Sau đó hai bên sẽ thống nhất với các đối tác về phần vốn đầu tư và giải pháp tài chính thu hồi vốn.

Theo Viện Khoa học & Công nghệ Phương Nam, việc đầu tư hệ thống đường sắt TP. Hồ Chí Minh - Cần Thơ là cần thiết bởi dự án phù hợp với quy hoạch đến năm 2020. Hơn nữa, kinh nghiệm của các nước như Mỹ, Canada cho thấy đường sắt phù hợp với đô thị hạt nhân, đô thị vệ tinh. Không những vậy việc xây dựng đường sắt TP. Hồ Chí Minh - Cần Thơ sẽ tác động đến sự phân công lao động chuyển dịch cơ cấu kinh tế của vùng ĐDSCL.